Shoko ISHIBAHI
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かえる日記
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核移植

    ＜準備するもの＞
  • アガロースディッシュ
    バランスディッシュ（小）やクライオモルド（大）等を利用し、四角い穴を60 mmペトリディッシュに作る。
  • 核移植用ニードル
    30 µl Drummond micropipetsを引く。レービス用は80-100 µm, トロピカリスは40-60 µmの直径となるよう、また鋭利になるよう針をピンセットで折る。
  • DNA
    適当な制限酵素でワンカットし、100 ng/µlとなるように調製する。複数の遺伝子を一緒に導入する場合は、複数の遺伝子を同じ酵素で処理する。
  1. レービスは２〜６日前に、トロピカリスは２〜３日前にPMSGを注射しておく。レービスは前日、トロピカリスは当日（４時間前）HCGを注射する。
  2. 脱ゼリー用に、レービスは2.5% L-Cysteine hydrochloride (pH 7.9-8.0)トロピカリスは2.0% L-Cysteine (pH 7.9-8.0)/1XMMRを準備する。また、レービスはSDB、トロピカリスはMOHを室温にもどしておく。
  3. レービス精子核4-4.5 µl（トロピカリスは10-15 µl; いずれも〜8X105nuclei）にDNA (100 ng/µl)を1µl加え、室温で5分インキュベートする。すべて先を切ったチップで取り扱う。
  4. レービスは18 µlのSDBと2 µlのegg extractを加える。制限酵素を加える場合は、10倍希釈したものを0.5 µl、2 µlの100 mM MgCl2を加える。トロピカリスの場合は2 µlのegg extractのみを加える。優しくピペッティングし、室温で15分インキュベートする。
  5. インキュベートしている間、卵をしぼる。システインで脱ゼリー後、1XMMRで３回ほど洗浄する。
  6. インジェクション用バッファー、レービスは0.4XMMR/6% Ficoll（15 ml 1XMMR/6% Ficoll＋35 ml 0.1%MMR/6% Ficoll）、トロピカリスは0.1XMMR/6% Ficollを入れたアガロースディッシュに、卵を並べる。
  7. レービスの場合反応液を5 µl分取し、150 µlのSDBに希釈、トロピカリスは反応液全量に130 µlのMOHを加え、針に充填する。
  8. レービスは10 nl/sec、トロピカリスは1.25 nl/secの流速で頑張って打つ。時々ちゃんと液が流れているか確認する。レービスの場合、針先にゴミ（白い精巣の残渣？）があるときは針を変えるか、思いきってピンセットで折って作業を続ける。
  9. インジェクション後、そのままレービスは16℃、トロピカリスは24-25℃のインキュベーターに入れる。トロピカリスはインジェクターのベンチに放置する（2003年4月1日現在まだ実際に試してはいません。しかし今まで遠くのインキュベーターに運んでいて、一回につき３ー４個の二次軸胚が得られています。きれいに原腸貫入するところがまたもったいない（笑）！）。
  10. 4細胞期（レービスは約３時間後、トロピカリスは約1.5時間後、ちょうどセカンドラウンドが終わるくらい)に綺麗に卵割した胚をスクリーニングする。
  11. レービスは0.1XMMR/6% Ficoll（16℃)、トロピカリスは0.01XMMR/6% ficoll（24-25℃）中で翌日まで飼う。トロピカリスの場合、アガロースコートした24wellディッシュで、１ウェル1-2個体で飼うと良い。
  12. 翌日、Ficoll無しのバッファーに置換する。

I. Egg Extractの調製
II. 精子核の調製
III. 核移植
☆石橋の考える、トランスジェニック作製におけるポイント
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