Shoko ISHIBAHI
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かえる日記
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精子核の調製

  1. 調製3-4日前レービすにPMSG100units、トロピかリスの場合調製1日前にPMSG30unitsを注射しておく。レービスは前日500units、トロピカリスは当日3時間前150unitsのHCGを注射する。
  2. 過剰麻酔で安楽死させたオスより精子を取り出す。
    レービスは一匹、トロピカリスは二匹のオスを使用。
    トロピカリスの場合、傷を付けずに取り出すことが望ましい。
  3. 1XMMRで軽く洗浄後（ペーパータオルに転がして血管を取ると楽）、1XNPBでリンスする。
  4. 空のペトリディッシュに移し、ピンセットを用いて精巣をほぐす。
  5. 1XNPBを5ml加え10mlピペットでよくピペッティングする。
  6. ガーゼを３、４枚重ねた漏斗に精巣けん濁液を通す。
  7. さらに5mlの1XNPBでディッシュを洗い、漏斗にアプライする。
  8. 手袋をして、ガーゼを絞る。
  9. 3000 rpm、4℃で10分遠心する。石橋的にはスイング推奨：）
  10. 上精をデカントで捨て、氷冷した10 mlの1XNPBを加えよくピペッティングする。
  11. 3000 rpm、4℃で10分遠心する。
  12. 上精をデカントで捨て、1mlの1XNPB、50µlのlysolecithin （レービス10 mg/ml、
    トロピカリス0.2 mg/ml）を加える。室温5分インキュベートする。
  13. 氷冷した10 mlの1XNPB/3% BSAを加え、3000 rpm、4℃で10分遠心する。
  14. 上精を捨て、氷冷した5 mlの1XNPB/0.3% BSAを加えよくピペッティングする。
  15. 3000 rpm、4℃で10分遠心する。
  16. 上精をデカントで捨て、500 µl（レービス）100 µl （トロピカリス）の1XNPB/0.3% BSA/30% glycerol を加える。
  17. 1µl分取し、SDBで100倍希釈しヘキストを加える。
  18. 血球計算盤で精子核の数をカウントする。
  19. 最終的にレービスは125-200X106 nuclei/ml、トロピカリスは80-100X106nuclei/mlとなるように調製する。
  20. 2-4反応分ずつ分注し、液体窒素もしくはドライアイスエタノールで急速冷凍し、ディープフリーザーに保存する。


I. Egg Extractの調製
II. 精子核の調製
III. 核移植
☆石橋の考える、トランスジェニック作製におけるポイント
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