A 18 de setembro de 1628 deixou São, Paulo a maior de todas as bandeiras que já haviam atacado o Guairá: 2 000 índios e novecentos mamelucos, dirigidos por 69 paulistas. No comando estava o mestre-de-campo Manuel Preto; seu imediato era Antônio Raposo Taváres. Atingindo a região pelo sudeste, os sertanistas atacaram sucessivamente as reduções de San Miguel, Santo Antônio, Jesus María, Encamación, San Xavier e San José. Diante do massacre, os padres reuniram em Santo Inácio e Loreto os índios sobreviventes e refugiaram-se nas missões estabelecidas entre os rios Paraná e Uruguai; os paulistas aproveitaram-se da retirada para destruir as povoações de Vila Rica e Ciudad Real, situadas respectivamente na margem esquerda do rio Ivaí e junto à foz do rio Piquiri; permitindo entretanto que seus habitantes fossem para o Paraguai, onde fundaram nova povoação às margens do rio Jejuí. Em 1632, não existia mais a província jesuítica do Guairá.

Nesse mesmo ano, Ascenso Ribeiro e André Femandes atacaram o Itatim. Transpondo o alto Paraná, ocuparam Santiago-de Xerez, perto das nascentes do rio Aquidauana, e destruíram as reduções de San José, Ángeles e San Pedro y San Pablo, recém-formadas pelos padres a oeste do rio Pardo. Enquanto a população de Santiago-de-Xerez confratemizava com os bandeirantes - muitos acabaram, inclusive, por se estabelecer em São Paulo -, foram dizimadas as reduções de San Pablo, Concepción de los Gualaxos, Santo Inácio e Loreto; em 1633, concluía-se a primeira fase da conquista do Itatim, com a evacuação pelos jesuítas das aldeias de Santa la Mayor e Natividad de Acaraig. A seguir, foi a vez das províncias do Tape e do Uruguai. Em julho de 1635, Luís de Leme (tio do Caçador de Esmeraldas) chegou ao sertão dos índios patos, junto à aldeia de Aracambi, em terras rio-grandenses, fazendo um reconhecimento inicial. No ano seguinte, desencadeou-se a ofensiva, comandada por Raposo Tavares à frente de 120 paulistas e 1 000 índios, que destruíram e ocuparam sucessivamente as missões de Jesus María, San Cristóbal e Santa Ana. Finalmente, em 1637, completou-se a destruição da província do Tape, com a ocupação das missões de Yequi e Santa Teresa de Ibituruna pelo bandeirante Francisco Bueno. Em 1638, chegou a vez da província do Uruguai. Chefiados por Fernão Dias Pais, os paulistas caíram sobre a região, derrotando os jesuítas em Caaró, Caazapáguazú, Caazapámini e San Nicolás.

Os padres e indígenas sobreviventes recuaram, então, para as reduções situadas entre os rios Uruguai e Paraná. Novos aldeamentos foram construídos e, pela primeira vez, organizou-se uma resistência eficaz contra os bandeirantes. Os tempos eram outros. Terminara a União Ibérica, em 1640, e a Espanha concordara em armar os índios, embora os grandes proprietários de Assunção tivessem tanto interesse no apresamento do indígena quanto os paulistas. Em 1641 , junto ao Mbororé, na margem esquerda do Uruguai, tropas guaranis derrotaram as bandeiras de Jerônimo Pedroso de Barros e Manuel Pires. Era um sinal de que a "caça ao índio" já não seria tão fácil como nos "bons tempos antigos". Na segunda metade do século XVII um número crescente de expediçôes partiria de São Paulo em busca de ouro e pedras preciosas. O bandeirismo de apresamento chegava ao fim, depois de capturar, ao longo do século XVII, milhares de "peças" e assestar um golpe decisivo nas missões jesuíticas, que constituíam uma experiência única de colonização em terras americanas. Foi este o altíssimo custo do recuo da linha de Tordesilhas, que tornou viável a presença portuguesa na América e também praticamente definiu as dimensões atuais do território brasileiro.