Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) является конечным продуктом превращений серусодержащих аминокислот, относительно незаменимым нутриентом, обладающий свойствами нейромодулятора [1-3]. Метаболические сдвиги при назначении фармакологически активных доз таурина [4-9] патогенетически обосновывают рациональность его применения для целенаправленной коррекции метаболического дисбаланса и предполагают разработку лекарственных препаратов на его основе при заболеваниях центральной нервной системы [4].
Одновременно известно, что метаболические воздействия, влияющие на уровень таурина в организме, приводят к выраженным изменениям аминокислотного пула в физиологических жидкостях и периферических тканях и вызывают дисбаланс фонда нейроактивных соединений. В особенности это характерно для ситуаций метаболического дисбаланса, возникающих на фоне сочетанных поражений печени и ЦНС [10,11].
Практически неисследованным остаётся регуляторное действие таурина на обмен нейромедиаторов и опосредованные им процессы формирования пула нейроактивных аминокислот, биогенных аминов и их метаболитов в различных по функциональной и метаболической направленности отделах головного мозга. Показано, что значительная часть нейрохимических эффектов аминокислот может быть реализована системными (энтеральным или парентеральным) способами их введения с одновременным воздействием на процессы формирования аминокислотного фонда в периферических тканях (печени, сердце, скелетных мышцах), характер которого необходимо учитывать при разработке способов целенаправленной коррекции метаболического баланса [12,13].
Так как проницаемость таурина в мозг при периферических способах его введения относительно невысока, а также учитывая особенности кровоснабжения некоторых структур ЦНС, в частности, гипоталамуса, субконъюнктивальное введение препарата, по нашему предположению, оправдано для для выяснения регуляторного действия его эндогенных концентраций, так как позволяет обеспечить прямое поступление таурина в мозг.
Целью данной работы
было исследование влияния таурина, вводимого субконъюнктивально, на формирование
пула свободных аминокислот головного мозга, а также гипоталамуса как отдела,
в который, из-за особенностей строения гематоэнцефалического барьера, таурин
проникает при субконъюнктивальном введении. Для сравнения нами были исследованы
также эффекты внутримышечного введения таурина в дозе, рекомендуемой для
включения таурина в состав искусственных смесей для энтерального питания.
Внутримышечный способ введения был применён нами для корректности сравнения
эффектов таурина, полученных при его субконъюнктивальном введении, которое
можно отнесено к парентеральным. Энтеральные способы введения таурина обуславливают
особенности его фармакокинетики, связанные с его конъюгацией с желчными
кислотами в ткани печени.
В эксперименте использовались белые беспородные крысы-самки массой 150-180 г, находившиеся на обычном рационе вивария со свободным доступом к воде. Первой опытной группе животных в течение 30 дней вводили таурин субконъюнктивально в суммарной дозе 360 мг/кг, в объеме 60 л 4% раствора в сутки. Контрольные животные аналогичным образом получали изотонический раствор хлорида натрия. Второй опытной группе таурин в виде 4% раствора вводили внутримышечно ежедневно в течение 30 сут в дозе 40 мг/кг в сутки. Контролем в данном случае служили животные, получавшие аналогичным образом изотонический раствор хлорида натрия.
Крыс забивали декапитацией. Кровь (200 мкл) собирали в гепаринизированные пробирки и получали плазму центрифугированием на холоду. Образцы тканей (печени, головного мозга) забирали в течение 1 мин после забоя и фиксировали в жидком азоте. Головной мозг извлекали и Гипоталамус препарировали на холоду [14]; пробы фиксировали в жидком азоте в течение 2 мин после забоя. Выбор гипоталамуса в качестве объекта исследования обусловлен тем, что в нем наиболее высока проницаемость гематоэнцефалического барьера (что может означать высокую функциональную активность систем активного транспорта). Кроме этого в гипоталамусе представлены практически все трансмиттерные системы ЦНС, в том числе значительная часть серотонинергических нейронов.
В работе использовали: стандарты аминокислот, биогенных аминов и их метаболитов фирм Fluka, Serva, Sigma, Reanal; остальные реактивы - отечественного производства (квалификации не ниже хч) или фирмы "LaChema" (ЧСФР). Органические растворители имели квалификацию "осч для жидкостной хроматографии". Экстракционные среды и подвижные фазы, а также растворы стандартов готовили с использованием воды для ВЭЖХ, полученной тройной дистилляцией в стеклянном аппарате с последующим пропусканием через патрон "Norganic" и фильтрованием через мембранный фильтр HATF 0,45 мкм (Millipore, США). Хроматографические определения и отработку методов проводили на хроматографе Waters (Waters Assoc., США) и автоматическом хроматографе Т-339 (ЧСФР). В работе использовались: системы подачи растворителя М501, модуль термостатирования колонок ТСМ, инжектор Rheodyne 7125, детектор флуоресценции М420. Прием и обработка хроматографических данных осуществлялась с помощью программно-аппаратного комплекса "МультиХром-1" (а/о "МультиХром", г.Москва; версия программного обеспечения - 2.67).
Количественная и качественная идентификация свободных аминокислот и их дериватов проводилась катионообменной хроматографией одноколоночным методом [15,16] на автоанализаторе аминокислот Т-339 (Чехия). После нанесения кислотного экстракта физиологических жидкостей или тканей на аналитическую колонку (22,0 х 0,35 см), заполненную сферическим катионообменником LGAN 2B (размер частиц 8 мкм) ("Lachema", Чехия) хроматографическое разделение исследуемых соединений последовательно осуществлялось пятью Li-цитратными буферами. Скорость потока растворов 14 мл/час, рабочее давление на колонке 2,5-3,5 МПа. Температура анализа дискретно повышалась в середине аналитического цикла с 40 до 62°С. Количественное содержание каждого компонента спектра исследуемых соединений оценивалось по реакции с 1% раствором нингидрина (скорость протока 12 мл/час) в капиллярной бане при 100°С при длине волны 520 нм после прохождения через проточную кювету однолучевого фотометра. Сигнал с выхода фотометра поступал на программно-аппаратный комплекс "МультиХром-1", где происходила регистрация, обработка, идентификация пиков и вычисление концентраций по площадям пиков.
Качественная идентификация и количественная оценка полученных значений производилась программой путем сравнения результатов анализа исследуемых биологических объектов со стандартной калибровочной кривой искусственной смеси аминокислот и нингидринположительных компонентов. Последняя содержала равные количества определяемых соединений по 250 нмоль/мл каждого и в качестве внутреннего стандарта в нее добавляли в той же концентрации норлейцин (концентраты стандартных смесей фирмы "Calbiochem", США).
В связи с недостаточной чувствительностью метода ионнобменной хроматографии с нингидриновым детектированием определение уровней нейроактивных аминокислот в гипоталамусе проводили методом ВЭЖХ в хлорнокислых экстрактах. Образец ткани (20-80 мг) взвешивали и гомогенизировали в 10 объемах 0,2 М HClO4, содержащей внутренний стандарт - 2,5 мМ -аминовалериановую кислоту, а также 50 мг/л ЭДТА и 50 мг/л Na2S2O5 в качестве антиоксиданта.
Свободные аминокислоты разделяли методом обращенно-фазной хроматографии на колонке 3х150 мм, заполненной сорбентом Диасорб-130 С16Т (8 м) (Элсико, Россия) с изократическим элюированием (127 мМ Nа+ - ацетатный буфер рН 5,9 : ацетонитрил : тетрагидрофуран, 85:3:12) при скорости потока 0,8 мл/мин, температуре 30°С после предколоночной дериватизации с офталевым альдегидом и 2-меркаптоэтанолом и флуориметрическим детектированием (338/425нм). В качестве реагента для дериватизации использовали 0,4 % раствор о-фталевого альдегида в 0,4 М Nа-боратном буфере рН 9,4, содержащий 0,4 % -меркаптоэтанола. Дериватизацию проводили путем смешивания образца (содержащего 0,2 М HClO4) и реагента в соотношении 1:3; через 1,5 мин пробу нейтрализовали добавлением 0,5 М HClO4 в объеме, равном исходному объему образца, после чего пробу фильтровали через мембранный фильтр 0,45 мкм (Millipore) и немедленно вводили в хроматограф (объем ввода - 20 мкл) [17,18]. Время с момента начала дериватизации до ввода пробы поддерживалось постоянным из-за химической нестойкости изоиндольных дериватов аминокислот с о-фталевым альдегидом и -меркаптоэтанолом, особенно для Asp и Glu [19].
Средние значения показателей в группах сравнивали
с помощью Т-критерия Стьюдента с использованием статистических программ
для медико-биологических исследований 3d из пакета ВМDР (BMDP Statistical
Software).
Внутримышечное введение таурина (табл. 1) приводило к повышению содержания в гипоталамусе аргинина и глицина, и практически не изменяло содержание таурина, как и других аминокислот-трансмиттеров. Не изменялось также и соотношение возбуждающих и тормозных аминокислот-трансмиттеров.
Субконъюнктивальное введение таурина вызывало тенденцию к повышению содержания в гипоталамусе нейротрансмиттера возбуждающего типа глутаминовой кислоты и приводило к повышению концентраций нейроактивных соединений тормозного типа - глутамина, таурина и ГАМК. Отношение суммы концентраций тормозных аминокислот-трансмиттеров (глицин, таурин и ГАМК) к возбуждающим имело выраженную тенденцию к росту (табл. 1).
Таким образом, субконъюнктивальное введение таурина способно индуцировать более существенные сдвиги в содержании нейроактивных аминокислот гипоталамуса, чем системное (внутримышечное) введение даже в более высокой дозе. В то же время, при субконъюнктивальном введении препарата нами не было зарегистрировано статистически значимых изменений в содержании аминокислот и их производных в целом мозге животных, хотя таковые наблюдались после внутримышечного введения (снижение уровней фосфоэтаноламина, аспартата и серина) (табл. 2). Внутримышечное введение таурина в течение 30 сут, кроме того, привело к снижению в плазме крови концентраций серина, изолейцина и лейцина (табл. 3). Ни субконъюнктивальное, ни внутримышечное введение таурина в указанной дозе практически не вызвало изменений в формировании фонда свободных аминокислот и их производных в печени (табл.4).
Полученные результаты подтверждают существование специфических для гипоталамуса систем транспорта таурина и возможность воспроизведения в этой структуре нейрохимических эффектов, индуцируемых таурином, при длительном субконъюнктивальном введении. К этим эффектам, очевидно, следует отнести изменение соотношения тормозных аминокислот-трансмиттеров [20,21,22] к возбуждающим преимущественно за счет роста содержания тормозных.
Можно также предположить, что рост содержания ГАМК в гипоталамусе при субконъюнктивальном введении таурина не был связан с усилением ее синтеза так как на этом фоне отчётливо видна тенденция к повышению уровня глутамата (табл. 1). Возможно, длительное введение таурина явилось причиной ингибирования активности глутаминазы в нейрональном компартменте, на что указывает значительный рост содержания глутамина при менее выраженном изменении в содержании глутамата. Предположение об усилении синтеза глутамина в глие менее вероятно из-за повышения содержания ГАМК, которая является предшественником глутамина [22].
Таким образом, периферические (системные) способы введения таурина позволяют получить нейрохимические сдвиги при длительном введении, из чего вытекает возможность применения таурина для коррекции дисбаланса в содержании свободных аминокислот в структурах ЦНС, т.е. практического использования нейромодуляторных свойств таурина. Однако, несмотря на большую длительность эксперимента, нам не удалось достичь такой выраженности эффектов, как после инстилляций препарата в конъюнктивальный мешок в существенно более низкой дозе. В последнем случае не отмечалось влияния препарата на аминокислотный фонд на периферии. В пользу существования специфической системы транспорта таурина в гипоталамические структуры свидетельствует то, что в целом мозге при субконъюнктивальном введении препарата не наблюдалось изменений в содержании аминокислот, хотя таковые имели место после внутримышечного введения.
Таблица 1
Содержание свободных аминокислот в гипоталамусе крыс после длительного внутримышечного и субконъюнктивального введения таурина, нмоль/г ткани
Показатель | Контроль
(в/м введение) |
Таурин в/м
40 мг/кг в сутки, 30 сут |
Контроль, субконъюнктивальное введение | Таурин, субконъюнктиваль
ное введение |
Asp | 2087309 | 2930224 | 2244290 | 3209361* |
Glu
возб AK (В) |
9352,7300
11440609 |
10495426
13426652 |
9141699
113879090 |
111152933
14325655 |
Ser | 750,972,1 | 721,5137,9 | 1816,7940,9 | 2171,5989,2 |
Gln | 2962492,5 | 3858,7513,2 | 3542,4891,1 | 7428,11246,8* |
Arg | 368,673,4 | 670,349,3+ | 1673,21402,3 | 408,5131,4 |
Gly | 1177,1103 | 171592+ | 1412321 | 2062357 |
Thr | 1068,4124 | 1460,8164,0 | 1242,9228,2 | 1640,2139,1 |
PEA | 1281,1195 | 991,7890 | 961,6135,6 | 1760,6277,4 |
Ala | 258,339,4 | 254,024,3 | 569,6199,4 | 311,822,9 |
-ala | 54,413,96 | 132,253,9 | 99,519,0 | 116,621,9 |
Tau | 2810,7482 | 2268,9318,0 | 1908,9547,1 | 3257,5150,9* |
GABA
торм AK (Т) |
4649778
86381364 |
6043,1398,6
10679810 |
4707,8523,0
80291391 |
7929,4991,6*
132501501 |
AK | 544974640 | 649144425 | 5340111047 | 802249045 |
Т/В | 0,755 | 0,795 | 0,705 | 0,925 |
* - p<0,05 по отношению к контролю (субконъюнктивальное введение)
Таблица 2
Содержание свободных аминокислот и их производных в целом мозге крыс после длительного внутримышечного и субконъюнктивального введения таурина, нмоль/г ткани
Показатель | Контроль
(в/м введение) |
Таурин в/м
40 мг/кг в сутки, 30 сут |
Контроль, субконъюнктивальное введение | Таурин, субконъюнктивальное введение |
CA | 68,79,5 | 56,64,8 | 58,53,6 | 54,64 |
Tau | 4854172,4 | 4240,2206,4 | 4339231,5 | 3970421,5 |
PEA | 1738,658, | 1490,452,6+ | 1685,2122,8 | 1427,6142,5 |
Asp | 3166,6179 | 2604,4160,6+ | 8991,75808,7 | 2358,8520,4 |
Thr | 763134,6 | 580,8143,5 | 664,2315,6 | 724,6133,4 |
Ser | 118965,7 | 887,473,8+ | 917,750,4 | 884113 |
Glu | 1066,8275 | 7710,81898,4 | 10591,7620,9 | 9441953,9 |
Gln | 7662,2152 | 5161,8466,4 | 7922,21158,9 | 10796,83564,3 |
Gly | 1613,6140 | 1377,879,6 | 1548,599,5 | 1189,2173,5 |
Ala | 915,665,1 | 808,268,3 | 786,239,7 | 78279 |
Val | 32524,2 | 237,734,9 | 238,745,9 | 245,221,2 |
Cys | 241,221,9 | - | - | - |
Ile | 461,685,1 | 541,47,7 | 537,510 | 445,265,6 |
Leu | 463,648,8 | 404,65,3 | 33554,2 | 495,5122,3 |
Tyr | 34830,2 | 3542,4 | 301,584,5 | 410,554 |
Phe | 146,644,1 | 119,65,6 | 1249 | 130,228,5 |
GABA | 2635,235 | 227973,6 | 2484,7110,8 | 2213,2190,7 |
EA | 43118,8 | 36731,6 | 416,515,6 | 388,657,5 |
NH3 | 1170,250 | 1017,2121,3 | 1227,5139,7 | 1637369 |
Lys | 23632,9 | 284,2131,3 | 202,545,4 | 374,7198 |
His | 164,847 | 9512,3 | 132,725,4 | 188,683,6 |
* - p<0,05 по отношению к контролю (субконъюнктивальное введение)
Таблица 3
Содержание свободных аминокислот и их производных в плазме крови крыс после длительного внутримышечного и субконъюнктивального введения таурина, М
Показатель | Контроль
(в/м введение) |
Таурин в/м
40 мг/кг в сутки, 30 сут |
Контроль, субконъюнктивальное введение | Таурин, субконъюнктивальное введение |
CA | 3,80,5 | 5,50,9 | 1510,7 | 7,31,4 |
Tau | 237,438,6 | 317,732,1 | 262,731,8 | 198,39 |
Asp | 39,65,0 | 32,23,6 | 38,79 | 361,0 |
Thr | 304,647,7 | 315130,2 | 305,2179,2 | 290,794,7 |
Ser | 556,257,1 | 378,261,5+ | 431,7105,2 | 423,770,5 |
Glu | 731,8101 | 698,257,6 | 616,7107,6 | 682,394,7 |
Gly | 378,845,6 | 419,523,7 | 392,252,7 | 756346,7 |
Ala | 1172,6112 | 1558,7128,4 | 1444,5453,9 | 1056464,4 |
-ABA | 99,86,9 | 793,6 | 7810 | 1120 |
Val | 253,426,5 | 28324,5 | 292,754,9 | 278,764,9 |
Cys | 86,610,6 | 150,230,4 | 162,567,5 | 15543,2 |
Met | 121,711,3 | 85,516,5 | 89,525,5 | 270 |
Ile | 310,449,0 | 153,36,4+ | 121,754,5 | 175,336,7 |
Leu | 229,813,7 | 33518,6+ | 363144,7 | 27264,9 |
Tyr | 995,2 | 165,734,6 | 25639,8 | 235,7100,1 |
Phe | 5417,6 | 105,717,5 | 117,319,7 | 11616,2 |
EA | 78,617,3 | 73,53,3 | - | 4821,3 |
NH3 | 271,429,1 | 305,235,5 | - | 32149,4 |
Orn | 638 | 61,713,3 | 75,226,9 | 60,57,5 |
Lys | 278,855,7 | 20243 | 415,793,6 | 366,3126,3 |
His | 98,819,8 | 94,78,8 | 173,774,2 | 146,740,8 |
* - p<0,05 по отношению к контролю (субконъюнктивальное введение)
Таблица 4
Содержание свободных аминокислот и их производных в печени крыс после длительного внутримышечного и субконъюнктивального введения таурина, нмоль/г ткани
Показатель | Контроль
(в/м введение) |
Таурин в/м
40 мг/кг в сутки, 30 сут |
Контроль, субконъюнктивальное введение | Таурин, субконъюнктивальное введение |
CA | 246,249,8 | 227,840,6 | 259,714,4 | 36834* |
Tau | 2525293,8 | 2512231 | 2262564,0 | 2286,2230,1 |
PEA | 1963,7547 | 1461,2177 | 1365,2412,7 | 928,286,3 |
Urea | 9130 | 2415,52149,5 | 1112,7750,9 | 469,3146,4 |
Asp | 2865,2297 | 2972,6321,1 | 1948,7283,7 | 1793,8485,6 |
Thr | 622243,6 | 761,3320,8 | 513,3273,4 | 494,7137,9 |
Ser | 2545262 | 1941414,6 | 1837,7342,5 | 2165,8171,8 |
Glu | 1964531,2 | 1588114,4 | 1377240,1 | 1953343,7 |
Gln | 8534,7887 | 8047,2468,3 | 7003,5698 | 6168,4371,7 |
Pro | 3759,7738 | 55511007,5 | 19058,28070,7 | 11905,45522,6 |
Gly | 2664,2314 | 3368,8380,1 | 3020534,7 | 2880,2480,6 |
Ala | 6412,7604 | 6831,2366,5 | 6015990,1 | 7883,6195,5 |
Val | 220,786,7 | 174,429,2 | 27260,6 | 237,8108,7 |
Cys | - | - | 346,0 | 47,69,8 |
Met | 115,566,1 | 33,76,5 | 171,765,4 | 5826,4 |
Ile | 36473,1 | 350,790,4 | 302,2120 | 365,8101,4 |
Leu | 34388,4 | 402,457,5 | 379,7114,7 | 421,677,6 |
Tyr | 250,776,4 | 201,756,4 | 137,259,6 | 162,441,2 |
Phe | 9621,7 | 12516 | 188,5118,5 | 156,655,2 |
-Ala | 697,5194 | 539,484,6 | 548,2180,5 | 404,7189,5 |
EA | 676,2134 | 636,427,4 | 520,222,2 | 63460,7 |
NH3 | 9752,5805 | 2197,8278,5 | 2499,75425,7 | 10929,85192,2 |
Orn | 433,5173 | 255,410,0 | 225,567,7 | 189,631 |
Lys | 592,54061 | 249,261,9 | 370,5120,4 | 580,2124,8 |
His | 328,21219 | 324,6123,1 | 822,788,1 | 76569,6 |
Key words: taurine, pharmacology, amino acid, neurotransmitters.
We investigated the influence of taurine after its subconjunctival administration (30 days, total dosage 360 mg/kg, in 60 l of 4 per cent solution) on the formation of the pool of free amino acids of the whole brain and hypothalamus of rats as well as the effects of intramuscular administration of taurine in doses recommended for its addition to the amino acid mixtures for enteral use (40 mg/kg per day, 30 days, as 4 per cent solution)
We showed the intramuscular taurine administration to have virtually no effect on the taurine concentration as well as other transmitter amino acids and ratio of the excitatory and inhivitory ones in the brain. Subconjunctival administration of taurine led to an increase of the ratio of inhibitory transmitter amino acids to excitatory ones. Therefore, the subconjunctival administration of taurine can induce more pronounced shifts in the concentrations of the neuroactive amino acids in the hypothalamus than its intramuscular administration even in higher dosage. However, we could not register any statistically significant changes in the concentrations of amino acids and their derivatives in the whole brain of animals though the changes were significant after intramuscular administration. Neither subconjunctival nor intramuscular administration of taurine did not induced any changes in the liver amino acid pool.
Our results confirm the existance of specific transport systems for taurine in the hypothalamus as well as the possibility to induce the neurochemical effects of taurine in this brain regio by prolonged subconjunctival administration. Peripheral (systemic) ways of the administration allow to obtain the neurochemical effects after multiple injections.