Установление механизмов реализации биологической активности отдельных аминокислот и их производных непосредственно связано с решением проблемы целенаправленной регуляции метаболического баланса.

В последнее время особый интерес исследователей привлекает естественный продукт превращений серусодержащих аминокислот таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота), являющийся относительно незаменимым нутриентом с присущими ему радио-, гепато- и кардиопротекторными свойствами [3, 5-7, 9-13, 15,16,18]. По современным представлениям, биологическая роль этого соединения включает регуляцию окислительно-восстановительных реакций, ионных потоков и проницаемости клеточных мембран [4,14], а также процессов нейромодуляции в возбудимых тканях [1].

В многочисленных исследованиях продемонстрированы адаптивные сдвиги в обмене веществ при назначении фармакологически активных доз таурина [20-25], которые предполагают разработку лекарственных препаратов на его основе при заболеваниях центральной нервной системы [20]. Однако до сих пор остаются неисследованными регуляторные механизмы влияния таурина в концентрациях, сравнимых с эндогенными, на метаболические процессы, опосредующие реализацию его биологического действия. Доказательств прямой причастности таурина к многообразным физиологическим феноменам в возбудимых тканях, в которых таурин проявляет свойства нейромодулятора тормозного типа, более чем достаточно. Показано, что значительная часть нейрохимических эффектов аминокислот может быть реализована системными (энтеральным или парентеральным) способами их введения с одновременным воздействием на процессы формирования аминокислотного фонда в периферических тканях (печени, сердце, скелетных мышцах), характер которого необходимо учитывать при разработке способов целенаправленной коррекции метаболического баланса [2,8]. Однако, учитывая относительно плохую проницаемость таурина в мозг при периферических способах его введения (эффект повышения концентрации таурина в головном мозге в таких экспериментальных моделях достигался многократными инъекциями относительно больших доз препарата), для выяснения регуляторного действия эндогенных концентраций этого соединения оправдано субконъюнктивальное введение препарата: особенности кровоснабжения некоторых структур ЦНС, в частности, гипоталамуса, позволяют приравнивать такой способ к центральным (введение в желудочки мозга или спинномозговой канал) и обеспечить прямое поступление таурина в мозг. Целью настоящего исследования было выяснение возможности проникновения и избирательного накопления таурина в центральной нервной системе крыс при его субконъюнктивальном введении.

Животные

Крысам-самкам массой 140-160 г однократно вводили в конъюнктивальный мешок ¹⁴C-Tau (по 30 Ci на животное, в каждый глаз в объеме 10 л, без носителя). Крыс забивали декапитацией через 30, 60 мин, 2, 3, 6, 8, 24, 48, 72 и 120 ч после введения.

Забор материала для исследования

Крыс забивали декапитацией. Кровь (200 мкл) собирали в гепаринизированные пробирки и получали плазму центрифугированием на холоду. Образцы тканей забирали в течение 1 мин после забоя и фиксировали в жидком азоте. Головной мозг извлекали и препарировали гипоталамус на холоду [19]; пробы фиксировали в жидком азоте в течение 2 мин после забоя. Выбор данного объекта исследования обусловлен тем, что гипоталамус является структурой с наиболее высокой проницаемостью гематоэнцефалического барьера (что может означать высокую функциональную активность систем активного транспорта).

Оборудование и реактивы

В работе использовали: стандарты аминокислот, биогенных аминов и их метаболитов фирм Fluka, Serva, Sigma, Reanal; остальные реактивы - отечественного производства (квалификации не ниже хч) или фирмы "LaChema" (ЧСФР). Органические растворители имели квалификацию "осч для жидкостной хроматографии". Экстракционные среды и подвижные фазы, а также растворы стандартов готовили с использованием воды для ВЭЖХ, полученной тройной дистилляцией в стеклянном аппарате с последующим пропусканием через патрон "Norganic" и фильтрованием через мембранный фильтр HATF 0,45 мкм (Millipore, США).

Подсчет радиоактивности

В безбелковых экстрактах тканей головного мозга и гипоталамуса, а также плазмы крови, приготовленных так же, как для анализа свободных аминокислот, производили подсчет радиоактивности на жидкостном сцинцилляционном счетчике "Mark-II". Состав диоксанового сцинциллятора: 4 г/л PPO, 0,2 г/л POPOP, 10% метанола, 60 г/л нафталина, 20 мл/л этиленгликоля.

Математическая обработка результатов

Средние значения показателей в группах сравнивали с помощью Т-критерия Стьюдента с использованием программам для медико-биологических исследований из пакета ВМDР (BMDP Statistical Software) [17].
 

Сравнительно низкая проницаемость гематоэнцефалического барьера для таурина затрудняет воспроизведение его нейрохимических эффектов при периферических способах введения. Особенности кровоснабжения и проницаемости гематоэнцефалического барьера для гипоталамуса позволяют предполагать реализацию возможных нейрохимических эффектов таурина при субконъюнктивальном способе его введения и, возможно, приравнять его к центральным. В связи с тем, что для таурина не доказано наличие иных метаболических превращений, кроме конъюгации с желчными кислотами, мы исходили из предположения, что весь определяемый нами счет метки относится к таурину.

Результаты эксперимента по исследованию закономерностей распределения меченого ¹⁴C-таурина при его субконъюнктивальном введении животным свидетельствуют о наличии накопления метки в ткани гипоталамуса с максимумом через 6 ч после введения препарата (рис.1) и одновременным снижением уровня метки в плазме крови животных (рис 2).

На этом фоне кривая накопления ¹⁴C-таурина в целом мозге (рис.3) имеет вид, сходный с таковой для гипоталамуса, однако в мозге отмечается рост счёта метки вплоть до 5 сут эксперимента. Одновременно, кривая, отражающая закономерности накопления ¹⁴C-таурина для плазмы крови (рис.2) соответствует классической кривой элиминации, за исключением падения счета через 2 ч, после чего вновь наблюдалось увеличение счета (3 и 6 ч).

На основе полученных данных можно предположить существование процессов пассивной диффузии и активного транспорта таурина в гипоталамус при его субконъюнктивальном введении. Указанные процессы определяются особенностями кровоснабжения этого отдела, на что указывает высокий уровень накопления меченого ¹⁴C-таурина в гипоталамусе уже через 30 мин после введения метки (рис.1). Очевидно, что в дальнейшем (1-120 ч) таурин проникает в мозг только путём активного транспорта, что подтверждается характером элиминации метки из крови: наиболее интенсивное накопление метки в гипоталамусе (6 ч) по времени совпадает с резким снижением счёта в плазме крови, где эта кривая явно отклоняется от обычной экспоненциальной формы (рис.2).

Рис. 1. Накопление метки в ткани гипоталамуса после однократного субконъюнктивального введения 30 Сi ¹⁴C-таурина

Рис. 2. Счет метки в плазме крови крыс через различные сроки после однократного субконъюнктивального введения 30Сi ¹⁴C-таурина.

Рис. 3. Накопление метки в целом мозге крыс после однократного субконъюнктивального введения 30Сi ¹⁴C-таурина

Из полученных нами данных очевидно, что мозг имеет более чем одну систему активного транспорта таурина: с более низким сродством была активной и явно превалировала в гипоталамусе в ранние сроки (3 ч) от введения ¹⁴C-таурина, т.е. на фоне высокой концентрации метки в системном кровотоке; другая, очевидно, была ответственной за поздний (до 120 ч) подъём кривой в целом мозге и, таким образом, может быть преимущественно представлена в других структурах ЦНС. Кроме этого, в гипоталамусе имеется также пассивная диффузия таурина, чем объясняется проникновение метки в первые минуты после введения. В то же время, в гипоталамусе вплоть до конца эксперимента счёт метки оставался стабильно высоким с тенденцией к наличию второго максимума накопления - к 3 сут после введения.

Кинетические константы для таурина, рассчитанные из данных настоящего эксперимента, составили:

а) в гипоталамусе:

константа элиминации 0,01016 ± 0,00552 мин^-1

период полувыведения Т_1/2 68,22 мин

константа скорости всасывания K_t 0,72122 ± 0,37076

среднее время всасывания 1,38 мин

период полувсасывания 0,96 мин

максимальная концентрация 3,32 (cpm*1000)

б) в плазме крови:

период полувыведения Т_1/2 13,88 час

константа элиминации 0,05 ± 0,026 мин^-1

Таким образом, данные настоящего эксперимента подтверждают, что таурин является относительно долгоживущим соединением в ЦНС, и свидетельствуют, что:

1) субконъюнктивальное введение таурина позволяет получить его избирательное накопление в гипоталамусе за счет пассивной диффузии соединения, что можно объяснить особенностями кровообращения этого отдела мозга - наличием у гипоталамуса и тканей глазницы общих путей венозного оттока;

2) мозг располагает как минимум двумя системами активного транспорта таурина, причем одна из них вызывает раннее, т.е. в первые часы после введения таурина, проникновение соединения, и представлена в гипоталамических структурах;

3) эффекты таурина при его субконъюнктивальном введении могут быть получены не только в гипоталамусе, но и в других структурах ЦНС и могут иметь длительный характер.

1. Гуревич В.С. Таурин и функция возбудимых клеток. Л.: Наука, 1986.
2. Западнюк В.И., Купраш Л.П., Заика М.С. Аминокислоты в медицине. - Киев: Здоров'я, 1982.
3. Мальчикова Л.С., Елизарова Е.П., Смирнова В.Н. Транспорт таурина в сердце // Метаболизм миокарда. - М., 1979.
4. Маньковская И.М., Вавилова Г.Л., Харламова О.Н. Носарь В.И., Братусь Л.В. Влияние таурина на активность транспортных АТР-аз и ферментов энергетического обмена в разных тканях крыс при острой гипоксической гипоксии // Укр. биохим. ж. - 1992. - Т.64, №6.
5. Маньковская И.М., Назаренко А.И., Носарь В.И., Новоруха Т.М., Сидоряк Н.Х. Новые пути патогенетической коррекции химической гипоксии // Фiзiол. ж. - 1992. - Т.38, №2.
6. Нефёдов Л.И. // Биологическая роль таурина (обзор). Весцi АН Беларусi.- 1992. - №3-4.
7. Нефёдов Л.И. // Метаболизм таурина у млекопитающих (обзор). Весцi АН БССР. - 1990. - №5.
8. Нефёдов Л.И. Формирование фонда свободных аминокислот и их производных в условиях метаболического дисбаланса: Автореф. дисс... д-ра медицинских наук. - Минск, 1993.
9. Нефёдов Л.И., Маслакова Н.Д, Цыркунов В.М. и др. Аминокислоты и их производные в патогенезе и лечении поражений печени (обзор)- Весцi АН Беларуси, сер. хим. наук, 1997, N2.
10. Попович М.И., Кобец В.А., Капелько В.И. Поражение сердца, вызываемое норадреналином, и защитный эффект таурина // Физиол. журнал. - 1990. - Т.36, №6.
11. Рыфф И.М., Елизарова Е.П., Орлова Ц.Р., Фарон Р.А., Пучкова В.А., Петрушенко А.Н. Патоморфологическая и морфометрическая оценка модели аортальной недостаточности у кроликов при лечении таурином // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1990. - Т.109, №6.
12. Силаева Т.Ю., Докшина Г.А. Изучение действия таурина на секреторную активность поджелудочной железы. // Вопр. мед. химии. - 1980. - Т.26, №1.
13. Таурин (фармакологические и противолучевые свойства) / Ярцев Е.И., Гольдберг Е.Д., Коменников Ю.А. - М.: Медицина, 1975.
14. Шустова Т.И., Машкова Н.Ю., Черкашина Е.М., Докшина Г.А. Влияние таурина на содержание калия, кальция и натрия в крови и тканях крыс // Вопр. мед. химии. - 1986. - Т. 32, №4.
15. Azuoma I., Halliwell B., Haey B.M. The antioxidant action of taurine, hypotaurine and their precursors // Biochem.J. - 1988. - V.256, N.1.
16. Bellentani S., Pecorari M., Cardoma P. Taurine increases bile acid pool size and reduced bile saturation index in the hamster // J. Lipids Res. - 1987. - V.28, N.9.
17. Dixon W. Biomedical Computer programs P-series. Bercley, Univ. Calif. Press, 1977.
18. Gandhi V.M., Cherian K.M., Mulky M.J. Hypolipidemic action of taurine in rats // Indian J. Exp. Biol. - 1992. - V.30, N.5. Glowinsky J., Iversen L.L. Regional studies of catecholamines in the rat brain. The disposition of [³H]-norepinephrine, [³H]-dopamine and [H]-DOPA in various regions of the brain // J.Neurochem. - 1966. - V.13, N.8.
19. Huxtable R., Pasantes-Morales H. Taurine in Nutrition and Neurology. - N.Y.: Plenum Press, 1978.
20. Huxtable R.J. Physiological action of taurine // Physiol. Rev. - 1992.
21. Kontro P. Transport and metabolism of taurine and hypotaurine in the brain. Acta Univ. Ouleen. - 1980.
22. Nakamura T., Ogasawa M., Koyama I., Nemoto M., Yoshida T. The protective effect of taurine on the biomembrane against damage produced by oxygen radicals // Biol. Pharm. Bull. - 1993.
23. Nakashima T., Seto Y., Toshikazu N., Shima T., Iwai Y., Zeizo K., Okanque T., Kashima K. Calcium-associated cytoprotective effect of taurine on the calcium and oxygen paradoxes in isoleted rat hepatocytes// Liver, 1990.
24. The role of amino acids in the brain / Quastel J.H., Marks V., Lajtha A., et al. - London. - N.Y.: Raven Press, 1979.

Key Words: amino acids, taurine, pharmacology, transport, brain

Thus, taurine has relatively high half-life in the CNS and its effects after subconjunctival administration might be obtained not only in the hypothalamus but in other CNS structures and might be revatively prolonged.