МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИОКСИДАНТА И ОТНОСИТЕЛЬНО НЕЗАМЕНИМОГО КОМПОНЕНТА ПИТАНИЯ ТАУРИНА В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ АТЕРОСКЛЕРОЗА

Р е ф е р а т^* На фоне увеличения концентрации Тау in vivo, вызванного его однократным в/бр введением крысам в дозе 0,1 LD₅₀ продемонстрированы его антирадикальная и антиокислительная активности. В печени животных увеличилось содержание фосфолипидов, снизились уровни этаноламина, глутамата, метионина и цистеата, возросли концентрации фосфоэтаноламина, восстановленного глутатиона и КоАSH, а также произошла активация митохондриальных цистеиндекарбоксилазы и цистеинтрансаминазы. Активность митохондриальных пируват- и 2-оксоглутаратдегидрогеназ, уровень 2-оксоглутарата и соотношение NAD⁺/NADH увеличивались, а соотношение ацетил-КоА/КоАSH уменьшалось. Результаты позволяют рассматривать возможность применение Тау в качестве антиатерогенного средства.

Библиогр.: 23 назв. Табл. 3.

Ключевые слова: атеросклероз, таурин, свободные аминокислоты, метаболизм

* Принятые в тексте сокращения: ААК - ароматические аминокислоты; АРУЦ - аминокислоты с разветвленной углеводородной цепью; ГДГ - глутаматдегидрогеназа; GSH - восстановленный глутатион; 2-ОГ - 2-оксоглутарат; 2-ОГД - 2-оксоглутаратдегидрогеназа; ПДГ - пируватдегидрогеназа; ТДФ - тиаминдифосфат; ЦД - цистеатдекарбоксилаза; ЦК - цистеат; ЦО - цистеиноксидаза; ЦТ - цистеинтрансаминаза.

В профилактике и лечении атеросклероза и его осложнений одно из ведущих мест отводится антиоксидантам природного происхождения [1]. Известно, что к последним в первую очередь относятся серусодержащие аминокислоты и их дериваты [2 - 8]. В связи с этим актуальным является исследование механизмов реализации биологической активности и формирования внутриклеточного фонда важнейшего продукта деградации серусодержащих аминокислот - таурина (Тау) [5, 8-14]. Так, показано, что при введении Тау in vivo он связывает Fe³⁺ и ОН^-радикалы на путях их генерации, оказывает гиполипидемическое и гипохолестеринемическое действие, активирует реакции всасывания и утилизации липидов и холестерина [9,10,5,15]. Кроме того, нейромодуляторные свойства и высокие концентрации Тау в тромбоцитах определяют его участие в процессах агрегации, тромбирования артерий и регуляции сосудистого тонуса [9].

Целью настоящей работы явилось выяснение вопроса о возможном вкладе процессов, прямо или косвенно влияющих на биосинтез Тау in vivo, в реализации его антиатерогенного действия. Для этого было необходимо определить изменения в уровнях свободных аминокислот и их производных, активность ферментативных реакций и концентрации субстратов обменных реакций, уровни коферментов, определяющих состояние мембран и окислительно-восстановительных процессов, в ситуации избыточного экзогенного поступления Тау.
 

В опытах использовались крысы-самцы массой 140-200 г, полученные из питомника РАМН "Рапполово", содержащиеся на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде.

Избыточное содержание Тау in vivo моделировали путем однократной внутрибрюшинной (в/бр) инъекции этого соединения в дозе, равной 1/10 LD₅₀ (650 мг/кг) на 30 мин [16].

Содержание свободных аминокислот и их производных в хлорнокислых экстрактах определяли одноколоночным методом ионообменной хроматографии (колонка 22,0х0,35, заполненная сферическим катионообменником LGAN-2В, 8m, Lachema) в Li-цитратной буферной системе с детектированием по реакции с нингидрином и фотометрией (520 нм) на автоанализаторе аминокислот ААА Т-339М ("Микротехна", Чехия) [17]. Митохондрии и гиалоплазму получали дифференциальным центрифугированием гомогенатов печени [18]. Активность ЦТ определялась путем инкубации митохондрий в присутствии цистеина, ПК и пиридоксаль-5-фосфата и оценивалась по количеству образующегося аланина [19]. В цитозольной фракции после её инкубации с цистеином и NAD⁺ без доступа кислорода по количеству образующегося цистинсульфината и цистеата определяли активность ЦО [19]. Активность ЦД оценивали радиометрическим методом по количеству выделенного [¹⁴CO₂] после инкубации митохондрий с [I-¹⁴C]- цистеатом и пиридоксаль-5-фосфатом [18]. Активность дегидрогеназ ПК и 2-ОГ в митохондриях измеряли феррицианидным методом или по декарбоксилированию [I-¹⁴C]-ПК и [I-¹⁴C]-ОГ [11]. Уровень ПК и 2-ОГ определяли по убыли NADН в лактат - или глутаматдегидрогеназной реакциях [18] соответственно; количество таурохолатов в гомогенатах печени - по абсорбции ацилированных конъюгатов, экстрагируемых с азуром-1 в хлороформ [15], GSН - по реакции SH-групп с реактивом Элмана [20], общий фонд КоА - по реакции ацетилирования с ариламином [18], содержание ацетил-КоА и свободной формы кофермента - методом ВЭЖХ на колонке Separon SGX-C₁₈, (15,0х0,3, 5m, "Элсико", Россия) с градиентным элюированием [21], содержание тиаминфосфатов - обращенно-фазной ВЭЖХ с постколоночной дериватизацией феррицианидом калия на колонке Диасорб-130 С₁₆Т (15,0х0,3, 8m, "Элсико", Россия) и детектированием по флуоресценции (360/450 нм). Митохондриальное соотношение свободных NAD⁺/NADH оценивали расчетным путем по глутаматдегидрогеназной реакции [22]. Определение общих фосфолипидов и их фракций проводили в липидном экстракте методом ТСХ [18]. Антирадикальную и антиоксидантную активность оценивали по гашению вспышек быстрой люминесценции на хемолюминометре "ЛХМ 1Ц-01".

Статистическая обработка данных реализована по программам для медико-биологических исследований из пакета BMDP [23].

Введение Тау вызвало увеличение концентрации этого соединения в печени, плазме крови в среднем в 2-3 раза (табл.1.). В плазме крови на этом фоне увеличилось содержание цистеата, а уровни метионина, аланина, серина, АРУЦ и ААК снизились на 50%. В печени содержание цистеина практически не изменилось, а метионина и цистеата снизилось вдвое. Так же, как и в плазме, в печени уменьшилось количество серина и, особенно - аланина, а треонина и глицина выросло. При этом возникли высокодостоверные отрицательные связи (р<0,02, r = -0,85 - 0,90) в содержании гликогенных аминокислот и АРУЦ печени и плазмы крови.

С позиций мембранотропных эффектов Тау возникшая метаболическая ситуация объясняется, прежде всего, активной экстракцией перечисленных аминокислот из кровеносного русла тканями, т.е. активацией в них метаболических процессов. Мембранстабилизирующее антиоксидантное действие Тау подтверждено нами в опытах in vitro, где Тау в концентрациях, соответствующих его уровню в тканях (10^-4 - 10^-6 М) (табл. 2), проявлял выраженную антирадикальную активность, подавляя на 30-40% люминесценцию спиртового раствора олеата, вызванную Fe²⁺.^. В гомогенатах печени опытных животных была достоверно выше на 12% суммарная антиокислительная активность. Приблизительно на столько же увеличилось в печени содержание общих фосфолипидов и их фракций - фосфатидилхолина и сфингомиелина, уровень этаноламина снизился, а фосфоэтаноламина увеличился (табл. 2). Перечисленные изменения, так же как и продемонстрированное нами увеличение уровня восстановленного глутатиона и КоАSН, снижение соотношения в печени АРУЦ/ААК, конкурирующих за общие транспортные системы при их поступлении в клетку [11], указывают на наличие мембранстабилизирующего, антиокислительного действия Тау.

Введение Тау с учетом перечисленных изменений в уровнях свободных серусодержащих аминокислот (снижение метионина и цистеата) индуцировало процессы транссульфурирования, поскольку активность митохондриальных ЦТ и ЦД увеличивалась более чем в 1,5 раза, а активность конкурирующей за общий субстрат ЦО в цитозоле не изменилась (табл. 3).

Активность митохондриальных ферментных систем, определяющих процессы окисления в ЦТК - глутаматдегидрогеназы, пируват - и 2-оксоглутаратдегидрогеназы на фоне введения Тау увеличивалась в 1,5-2 раза и в сумме с увеличением содержания 2-оксоглутарата и расчетной величины соотношения NAD⁺/NADH в митохондриях, уменьшением уровня глутамата, соотношения ацетил-КоА/КоАSН (табл. 3) свидетельствует об активации процессов гликолиза и утилизации углеродных скелетов аминокислот в цикле трикарбоновых кислот [11]. Это подтверждается существованием в печени опытных животных положительных корреляционных взаимоотношений таурина с уровнем КоАSН, активностью пируватдегидрогеназы, соотношением NAD⁺/NADH и отрицательной - с уровнем тиаминдифосфата (табл. 3).

Таким образом, повышение концентрации Тау in vivo, вызванное его дополнительным экзогенным введением активирует транспорт аминокислот из кровяного русла в ткани, процессы утилизации их углеродных радикалов в ЦТК и деградацию серусодержащих аминокислот, а также оказывает антиоксидантное действие, увеличивая содержание фосфолипидов и восстановленного глутатиона, что обосновывает применение Тау в качестве антиатерогенного средства.

Таблица 1

Содержание свободных аминокислот и их производных в печени (нмоль/г) и плазме крови (мкМ) крыс через 30 мин после однократного в/бр введения таурина (650 мг/кг)

Показатель	Печень		Плазма
	Контроль	Опыт	Контроль	Опыт
Цистеат	162 ± 15	80 ± 10*	17 ± 2	37 ± 4*
Таурин	3980 ± 191	9533 ± 961*	242 ± 20	1813 ± 54*
Аспартат	2571 ± 608	3184 ± 224*	44 ± 5	35 ± 3
Треонин	1473 ± 322	4419 ± 785*	405 ± 33	434 ± 28
Серин	3115 ± 455	2225 ± 305*	627 ± 29	405 ± 15*
Глутамат	3151 ± 156	1910 ± 82*	262 ± 48	245 ± 38
Глутамин	2690 ± 225	3500 ± 345*	62 ± 10	78 ± 12
Глицин	2012 ± 158	2916 ± 352*	507 ± 26	448 ± 32
Аланин	1083 ± 124	1451 ± 138*	1310 ± 72	814 ± 60*
Валин	405 ± 59	316 ± 24*	235 ± 17	135 ± 16*
Изолейцин	466 ± 69	345 ± 34*	103 ± 5	50 ± 3*
Лейцин	477 ± 73	329 ± 42*	244 ± 25	103 ± 6*
Тирозин	262 ± 26	248 ± 19	106 ± 10	54 ± 3*
Фенилаланин	283 ± 27	268 ± 17	70 ± 6	42 ± 3*
Метионин	301 ± 53	167 ± 23*	43 ± 3	32 ± 2*
Цистин	284 ± 27	483 ± 51*	48 ± 4	53 ± 4
Цистатионин	103 ± 20	92 ± 10	не опр.	не опр.
Аммиак	5692 ± 1034	6020 ± 900	801 ± 38	780 ± 34
Мочевина	2138 ± 225	2993 ± 367*	303 ± 32	290 ± 45

* - p<0,05 по отношению к контролю; не опр. - не определялся

Таблица 2.

Антиоксидантная активность, содержание общих фосфолипидов (мг/г ткани) и их фракций (в %), уровни ЭА, ФЭА, КоАSH (нмоль/г), GSH (мкмоль/г) и соотношение АРУЦ/ААК в печени крыс через 30 минут после в/бр введения таурина (650 мг/кг)

Показатель	Контроль (n=10)	Опыт (n=10)
Антиоксидантная активность (%)	27 ± 2,5	39 ± 4,0*
Общие фосфолипиды	22,5 ± 1,1	25,3 ± 0,9*
Фосфатидилхолин	45 ± 9	49,2 ± 1,2*
Фосфатидилэтаноламин	28,9 ± 1,1	29,2 ± 0,8
Сфингомиелин	9,6 ± 0,5	8,3 ± 0,4*
Лизофосфатидилхолин	6,8 ± 1,1	4,3 ± 0,7*
Кардиолипин	9,9 ± 1,4	9,6 ± 0,4
Этаноламин	428 ± 71	142 ± 20*
Фосфоэтаноламин	1659 ± 45	2832 ± 142*
КоАSH	249 ± 21	399 ± 63*
Глутатион	3,0 ± 0,1	3,6 ± 0,2*
АРУЦ/ААК	0,83	0,46

* - p<0,05 по отношению к контролю

Таблица 3

Активность ферментов, регламентирующих активность ЦТК (ГДГ, ПДГ, 2-ОГД) и деградацию цистеина (ЦО, ЦТ, ЦД) в нмоль/мг белка/мин, а также уровень 2-ОГ (нмоль/г ткани), ТДФ (мкмоль/г ткани) и соотношения митоходриальных NAD⁺/NADH в печени крыс через 30 минут после в/бр введения таурина (650 мг/кг)

Показатель	Контроль (n=10)	Опыт (n=10)
ПДГ	12 ± 1,6	16 ± 1,1*
2-ОГД	3,3 ± 0,7	8,3 ± 1,2*
ГДГ	8,2 ± 0,9	13,4 ± 1,2*
ЦО	0,69 ± 0,07	0,64 ± 0,03
ЦТ	2,44 ± 0,23	4,85 ± 0,32*
ЦД	4,52 ± 0,38	8,14 ± 0,65*
2-ОГ	25,3 ± 2,0	45,5 ± 4,1*
ТДФ	28,7 ± 1,6	14,8 ± 0,8*
NAD+/NADH	4,5	9,0
Ацетил-КоА/КоА	0,2 ± 0,02	0,13 ± 0,01*

* - p<0,05 по отношению к контролю.
 

1. Репин В.С., Смирнов В.Н. Фундаментальные науки против атеросклероза - Обзорная информация "Медицина и здравоохранение". - М., 1989.

2. Западнюк В.И., Купраш Л.П., Заика М.С. Аминокислоты в медицине. - Киев: Здоров'я, 1982. 

3. Клеменс М.Дж., Пейн В.М. Обеспеченность аминокислотами и их роль в клетках организма животных. // Белковый обмен и питание. - М., 1980. 

4. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма: Пер с англ. - М., Мир, 1977. 

5. Amino Acids (Chemistry, Biology, Medicine) / Ed. Lubec C., Rosental J.A. - N.Y.: Escom, 1990.

6. Blackburn G.L., Grant J.P., Yoring V.R. Amino Acid Metabolism and medical applications. - London: J. Wright Inc., 1983.

7. Cooper A.J.L. Biochemistry of sulfurcontaining amino acids // Ann. Rev. Biochem. - 1983.

8. Нефёдов Л.И. Проявления биологической активности таурина (обзор) // Весцi АН Беларусi.- 1992.

9. Гуревич В.С. Таурин и функция возбудимых клеток. - Л.: Наука, 1986.

10. Таурин (фармакологические и противолучевые свойства) / Ярцев Е.И., Гольдберг Е.Д., Коменников Ю.А. - М.: Медицина, 1975.

11. Hayes K., Sturman J.A. Taurine in metabolism // Ann. Rev. Nutr. - 1981.

12. Human nutritional compounds containing taurine and vitamins and/or minerals: Pat. 4751085 USA/Gaul G.E.(USA).

13. Huxtable R., Barbeau A. Taurine. - N.Y.: Raven Press, 1976.

14. Нефёдов Л.И. Метаболизм таурина у млекопитающих (обзор) //Весцi АН БССР. - 1990.

15. Azuoma I., Halliwell B., Haey B.M. The antioxidant action of taurine, hypotaurine and their precursors // Biochem.J. - 1988.

16. Фармакология и клиническое применение нейроактивных аминокислот и их аналогов / Под ред. Г.В. Ковалева.- Труды ВГМИ: Волгоград, 1985.

17. Нидервайзер А., Патаки Дж. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков: Пер. с англ. - М., Мир, 1974.

18. Обмен аминокислот / Под ред. А.Е. Браунштейна. - Тбилиси: Мецниереба, 1967.

19. Ishimoto Y. Transaminative pathways of cysteine metabolism in rat tissues // Physiol. Chem. - 1979.

20. Ballatori N. Hepatic transport and interorgan metabolism of Glutathione // Biol. Chem. - 1990.

21. Дорошенко Е.М., Шейбак В.М. Модифицированный способ определения КоА-SH и ацетил-КоА в ткани печени методом ВЭЖХ. VII Областная конференция молодых учёных и специалистов - тез. докл. - Гродно, 1991.

22. Великий Н.Н. Исследование регуляторной роли окислительно-восстановительного состояния никотинамидных коферментов во внутриклеточном метаболизме в тканях животных: Автореф.дисс...д-ра биол. наук. - Киев, 1987.

23. Нефёдов Л.И., Мороз А.Р., Островский Ю.М. Статистический анализ фонда свободных аминокислот печени крыс // Вопр. питания. - 1991.

Key Words: atherosclerosis, taurine, amino acids, metabolism

With liver and blood plasma Tau concentrations being increased, which was induced by its single i.p. administration at a dose of 0.1LD₅₀ (650 mg/kg), we demonstrated the antiradical and antioxidative activities of this compound (inhibition of Fe²⁺-induced chemoluminescence). The liver showed increased concentrations of general phospholipids, phosphatidylcholine and sphingophosphatides, the levels of ethanolamine, glutamate, methionine and cysteic acids were decreased, while the concentrations of phosphoethanolamine, reduced glutathione and CoASH raised and mitochondrial cysteine decarboxylase and cysteine transaminase activated. The activities of mitochondrial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase which regulate tricarboxylic acid cycle functions as well as the 2-oxoglutarate level and NAD⁺/NADH ratio were elevated, whereas the acetyl-CoA/CoASH ratio diminished, which indicates an enhanced carbon flow into the tricarboxylic acid cycle. All the above enables us to recommend Tau an antiatherogenic remedy. 

This page hosted by
Get your own Free Home Page